Скануючий зондовий мікроскоп. Курсова робота: Сканувальна зондова мікроскопія. Звіт з лабораторної роботи повинен включати

Вступ

В даний час бурхливо розвивається науково-технічний напрямок - нанотехнологія, що охоплює широке коло як фундаментальних, так і прикладних досліджень. Це принципово нова технологія, здатна вирішувати проблеми у таких різних галузях, як зв'язок, біотехнологія, мікроелектроніка та енергетика. Сьогодні більше сотні молодих компаній розробляють нанотехнологічні продукти, які вийдуть на ринок у найближчі два – три роки.

Нанотехнології стануть провідними, в 21 столітті, технологіями і сприятимуть розвитку економіки та соціальної сфери суспільства, вони можуть стати передумовою нової промислової революції. У попередні двісті років прогрес у промисловій революції було досягнуто ціною витрат близько 80% ресурсів Землі. Нанотехнології дозволять значно зменшити обсяг споживання ресурсів і не вплинуть на навколишнє середовище, вони будуть відігравати провідну роль у житті людства, як, наприклад, комп'ютер став невід'ємною частиною життя людей.

Прогрес у нанотехнології стимулювався розвитком експериментальних методів досліджень, найбільш інформативними з яких є методи скануючої зондової мікроскопії, винаходом і особливо поширенням яких світ завдячує нобелівським лауреатам 1986 - професору Генріху Рореру і доктору Герду Біннігу.

Світ був зачарований відкриттям настільки простих методіввізуалізації атомів, та ще й з можливістю маніпуляції ними. Багато дослідницьких груп почали конструювати саморобні прилади та експериментувати в даному напрямку. В результаті було народжено низку зручних схем приладів, були запропоновані різні методивізуалізації результатів взаємодії зонд-поверхня, такі як: мікроскопія латеральних сил, магнітно-силова мікроскопія, мікроскопія реєстрації магнітних, електростатичних, електромагнітних взаємодій. Набули інтенсивного розвитку методи близькопольної оптичної мікроскопії. Було розроблено методи спрямованого, контрольованого впливу в системі зонд-поверхня, наприклад, нанолітографія – зміни відбуваються на поверхні під дією електричних, магнітних впливів, пластичних деформацій, світла в системі зонд-поверхня. Були створені технології виробництва зондів із заданими геометричними параметрами, зі спеціальними покриттями та структурами для візуалізації різних властивостей поверхонь.

Сканувальна зондова мікроскопія (СЗМ) – один із потужних сучасних методівдослідження морфології та локальних властивостей поверхні твердого тіла з високою просторовою роздільною здатністю. За останні 10 років скануюча зондова мікроскопія перетворилася з екзотичної методики, доступної лише обмеженому числу дослідницьких груп, широко поширений і успішно застосовується інструмент для дослідження властивостей поверхні. В даний час практично жодне дослідження в галузі фізики поверхні та тонкоплівкових технологій не обходиться без застосування методів СЗМ. Розвиток скануючої зондової мікроскопії послужило також основою розвитку нових методів у нанотехнології – технології створення структур з нанометровими масштабами .

1. Історична довідка

Для спостереження дрібних об'єктів голландець Антоні ван Левенгук у 17 столітті винайшов мікроскоп, відкривши світ мікробів. Його мікроскопи були недосконалими і давали збільшення від 150 до 300 разів. Але його послідовники вдосконалили цей оптичний прилад, заклавши фундамент для багатьох відкриттів у біології, геології, фізиці. Однак наприкінці 19 століття (1872 р.) німецький оптик Ернст Карл Аббе показав, що через дифракцію світла роздільна здатність мікроскопа (тобто мінімальна відстань між об'єктами, коли вони ще не зливаються в одне зображення) обмежена довжиною світлової хвилі (0.4 – 0,8 мкм). Тим самим він заощадив масу зусиль оптиків, які намагалися зробити більш досконалі мікроскопи, але розчарував біологів і геологів, які втратили надію отримати прилад зі збільшенням вище 1500x.

Історія створення електронного мікроскопа – чудовий приклад того, як галузі науки і техніки, що самостійно розвиваються, можуть, обмінюючись отриманою інформацією та поєднуючи зусилля, створювати новий потужний інструмент наукових досліджень. Вершиною класичної фізики була теорія електромагнітного поля, яка пояснила поширення світла, виникнення електричних та магнітних полів, рух заряджених частинок у цих полях як поширення електромагнітних хвиль. Хвильова оптика зробила зрозумілими явище дифракції, механізм формування зображення та гру факторів, що визначають дозвіл у світловому мікроскопі. Успіхам у галузі теоретичної та експериментальної фізики ми зобов'язані відкриттям електрона з його специфічними властивостями. Ці окремі і, здавалося б, незалежні шляхи розвитку призвели до створення основ електронної оптики, однією з найважливіших програм якої був винахід ЕМ у 1930-х роках. Прямим натяком на таку можливість можна вважати гіпотезу про хвильову природу електрона, висунуту в 1924 році Луї де Бройлем і експериментально підтверджену в 1927 К.Девіссоном і Л.Джермером у США та Дж.Томсоном в Англії. Тим самим було підказано аналогію, що дозволила побудувати ЕМ за законами хвильової оптики. Х.Буш виявив, що за допомогою електричних та магнітних полів можна формувати електронні зображення. У перші два десятиліття 20 ст. були створені та необхідні технічні передумови. Промислові лабораторії, що працювали над електронно-променевим осцилографом, дали вакуумну техніку, стабільні джерела високої напруги та струму, хороші електронні емітери.

У 1931 Р.Руденберг подав патентну заявку на електронний мікроскоп, що просвічує, а в 1932 М.Кнолль і Е.Руска побудували перший такий мікроскоп, застосувавши магнітні лінзи для фокусування електронів. Цей прилад був попередником сучасного оптичного електронного мікроскопа (ОПЕМ). (Руска був винагороджений за працю тим, що став лауреатом Нобелівської премії з фізики за 1986.) У 1938 Руска і Б. фон Борріс побудували прототип промислового ОПЕМ для фірми «Сіменс-Хальське» в Німеччині; цей прилад дозволив досягти дозволу 100 нм. Декількома роками пізніше А.Пребус і Дж.Хіллер побудували перший ОПЕМ високого дозволу в Торонтському університеті (Канада).

Широкі можливості ОПЕМ майже відразу стали очевидні. Його промислове виробництво було розпочато одночасно фірмою «Сіменс-Хальське» у Німеччині та корпорацією RCA у США. Наприкінці 1940-х років такі прилади почали випускати й інші компанії.

РЕМ у його нинішній формі був винайдений у 1952 році Чарльзом Отлі. Щоправда, попередні варіанти такого пристрою були побудовані Кноллем у Німеччині у 1930-х роках та Зворикіним із співробітниками в корпорації RCA у 1940-х роках, але лише прилад Отлі зміг послужити основою для низки технічних удосконалень, що завершилися впровадженням у виробництво промислового варіанту РЕМ у середині 1960-х років. Коло споживачів такого досить простого у користуванні приладу з об'ємним зображенням та електронним вихідним сигналом розширилося зі швидкістю вибуху. В даний час налічується добрий десяток промислових виробників РЕМ"ів на трьох континентах і десятки тисяч таких приладів, що використовуються в лабораторіях всього світу. , де в 1970 був введений в дію прилад з прискорювальною напругою, рівним 3,5 млн. вольт.РТМ був винайдений Г.Біннігом і Р.Рорером в 1979 в Цюріху. зі створення РТМ Бінніг та Рорер (одночасно з Руською) отримали Нобелівську премію.

У 1986 році Рорером і Біннігом був винайдений зондовий мікроскоп, що сканує. З моменту свого винаходу СТМ широко використовується вченими різних спеціальностей, що охоплюють практично всі природничі дисципліни починаючи від фундаментальних досліджень в галузі фізики, хімії, біології і до конкретних технологічних додатків. Принцип дії СТМ настільки простий, потенційні можливостітакі великі, що неможливо передбачити його вплив на науку та техніку навіть найближчого майбутнього.

Як виявилося надалі, практично будь-які взаємодії гострого зонда з поверхнею (механічні, магнітні) можуть бути перетворені за допомогою відповідних приладів та комп'ютерних програму зображення поверхні.

Установка скануючого зондового мікроскопа складається з кількох функціональних блоків, зображених на рис. 1. Це, по-перше, сам мікроскоп з п'єзоманіпулятором для керування зондом, перетворювачем тунельного струму в напругу та кроковим двигуном для підведення зразка; блок аналого-цифрових та цифро-аналогових перетворювачів та високовольтних підсилювачів; блок керування кроковим двигуном; плата з сигнальним процесором, що розраховує сигнал зворотного зв'язку; комп'ютер, що збирає інформацію та забезпечує інтерфейс з користувачем. Конструктивно блок ЦАПів та АЦП встановлений в одному корпусі з блоком керування кроковим двигуном. Плата із сигнальним процесором (DSP – Digital Signal Processor) ADSP 2171 фірми Analog Devices встановлена ​​в ISA слот розширення персонального комп'ютера.

Загальний вигляд механічної системи мікроскопа подано на рис. 2. У механічну систему входить основа з п'єзоманіпулятором і системою плавної подачі зразка на кроковому двигуні з редуктором і дві вимірювальні вимірювальні головки для роботи в режимах скануючої тунельної і атомно-силової мікроскопії. Мікроскоп дозволяє отримати стійкий атомний дозвіл на традиційних тестових поверхнях без застосування додаткових сейсмічних та акустичних фільтрів.

7. Застосування скануючого зондового мікроскопа на дослідження біологічних об'єктів

7. Застосування скануючого зондового мікроскопа для дослідження біологічних об'єктів.

7.1. Цілі роботи 2

7.2. Інформація для викладача 3

7.4. Методичні вказівки 31

7.5. Техніка безпеки 32

7.6. Завдання 32

7.7. Контрольні питання 32

7.8. Література 32

Лабораторну роботу було розроблено Нижегородським Державним Університетом ім. Н.І. Лобачевського

7.1.Цілі роботи

Дослідження морфологічних параметрів біологічних структур є важливим завданням для біологів, оскільки розміри та форма деяких структур багато в чому визначають їх фізіологічні властивості. Порівнюючи морфологічні дані з функціональними характеристиками, можна отримати повноцінну інформацію про участь живих клітин у підтримці фізіологічного балансу організму людини або тварини.

Раніше біологи та медики мали змогу вивчати свої препарати лише на оптичному та електронному мікроскопах. Ці дослідження давали якусь картину морфології клітин, зафіксованих, забарвлених і тонкими металевими покриттями, отриманими шляхом напилення. Дослідити морфологію живих об'єктів, її зміни під впливом різних чинників було неможливо, але було дуже привабливим.

Сканувальна зондова мікроскопія (СЗМ) відкрила нові можливості у дослідженні клітин, бактерій, біологічних молекул, ДНК в умовах максимально наближених до нативних. СЗМ дозволяє досліджувати біологічні об'єкти без спеціальних фіксаторів та барвників, на повітрі, або навіть у рідкому середовищі.

В даний час СЗМ використовується у великому різноманітті дисциплін як у фундаментальних наукових дослідженнях, так і в прикладних високотехнологічних розробках. Багато науково-дослідних інститутів країни оснащуються апаратурою зондової мікроскопії. У зв'язку з цим постійно зростає попит на висококласних спеціалістів. Для задоволення фірмою НТ-МДТ (м. Зеленоград, Росія) розроблено спеціалізовану навчально-наукову лабораторію скануючої зондової мікроскопії. NanoEducator.

СЗМ NanoEducatorспеціально розроблено для проведення студентами лабораторних робіт. Цей прилад орієнтований на студентську аудиторію: він повністю управляється за допомогою комп'ютера, має простий та наочний інтерфейс, анімаційну підтримку, передбачає поетапне освоєння методик, відсутність складних налаштувань та недорогі витратні матеріали.

У цій лабораторної роботиВи дізнаєтеся про скануючу зондову мікроскопію, познайомитеся з її основами, вивчіть конструкцію та принципи роботи навчального СЗМ NanoEducator, навчитеся готувати біологічні препарати для досліджень, отримайте своє перше СЗМ зображення комплексу бактерій кисломолочних і навчитеся основам обробки та подання результатів вимірювань.

7.2.Інформація для викладача 1

Лабораторна робота виконується у кілька етапів:

1. Підготовка зразка виконується кожним студентом індивідуально.

2. Отримання першого зображення виконується одному приладі під контролем викладача, далі кожен студент досліджує свій зразок самостійно.

3. Обробка експериментальних даних кожним студентом провадиться індивідуально.

Приклад для дослідження: кисломолочні бактерії на покривному склі.

До початку роботи необхідно підібрати зонд з найбільш характерною амплітудно-частотною характеристикою (одинаковий симетричний максимум), отримати зображення поверхні зразка, що досліджується.

Звіт з лабораторної роботи повинен включати:

1. теоретичну частину (відповіді на контрольні питання).

2. результати експериментальної частини (опис проведених досліджень, отримані результати та зроблені висновки).

1. Методи досліджень морфології біологічних об'єктів.

2. Скануючий зондовий мікроскоп:

конструкція СЗМ;

різновиди СЗМ: СТМ, АСМ;

формат СЗМ даних; візуалізація СЗМ даних.

3. Підготовка зразків для СЗМ досліджень:

морфологія та структура бактеріальних клітин;

приготування препаратів для вивчення морфології із застосуванням СЗМ.

4. Знайомство з конструкцією та програмою управління СЗМ NanoEducator.

5. Отримання СЗМ зображення.

6. Обробка та аналіз отриманих зображень. Кількісна характеризування СЗМ зображень.

Методи дослідження морфології біологічних об'єктів

Характерний діаметр клітин становить 10  20 мкм, бактерій від 0.5 до 35 мкм, ці величини в 5 разів дрібніші за найдрібнішу частинку, видиму неозброєним оком. Тому перше вивчення клітин стало можливим лише після появи оптичних мікроскопів. Наприкінці XVII ст. Антоніо ван Левенгук виготовив перший оптичний мікроскоп, до цього люди не підозрювали про існування хвороботворних мікробів та бактерій [Літ. 7-1].

Оптична мікроскопія

Труднощі вивчення клітин пов'язані з тим, що вони безбарвні та прозорі, тому відкриття їх основних структур відбулося лише після введення у практику барвників. Барвники забезпечили достатню контрастність зображення. З допомогою оптичного мікроскопа можна розрізняти об'єкти, віддалені друг від друга на 0.2 мкм, тобто. Найменшими об'єктами, які ще можна розрізняти в оптичному мікроскопі є бактерії та мітохондрії. Зображення більше дрібних елементівклітин спотворюються ефектами, спричиненими хвильовою природою світла.

Для приготування препаратів, що довго зберігаються, клітини обробляють фіксуючим агентом для того, щоб іммобілізувати і зберегти їх. З іншого боку, фіксація підвищує доступність клітин барвникам, т.к. макромолекули клітин скріплюються поперечними зшивками, що стабілізує та закріплює їх у певному положенні. Найчастіше як фіксатори виступають альдегіди і спирти (наприклад, глутаральдегід або формальдегід формують ковалентні зв'язки з вільними аміногрупами білків і зшивають сусідні молекули). Після фіксації тканини зазвичай нарізують мікротом на дуже тонкі зрізи (товщиною від 1 до 10 мкм), які потім поміщають на предметне скло. При такому способі підготовки можна пошкодити структуру клітин або макромолекул, тому переважним методом є швидке заморожування. Заморожену тканину ріжуть мікротомом, встановленим у холодній камері. Після приготування зрізів клітини фарбують. В основному для цієї мети використовують органічні барвники (малахітову зелень, чорний судан і т.д.). Кожен з них характеризується певною спорідненістю до клітинних компонентів, наприклад, гематоксилін має спорідненість з негативно зарядженими молекулами, тому дозволяє виявити в клітинах ДНК. Якщо та чи інша молекула представлена ​​в клітині в незначній кількості, то найзручніше використовувати флуоресцентну мікроскопію.

Флуоресцентна мікроскопія

Флуоресціюючі барвники поглинають світло однієї довжини хвилі і випромінюють світло іншої, більшої довжини хвилі. Якщо таку речовину опромінити світлом, довжина хвилі якого збігається з довжиною хвилі світла, що поглинається барвником, і потім для аналізу використовувати фільтр, що пропускає світло з довжиною хвилі, що відповідає світлу, що випромінюється барвником, флуоресцентну молекулу можна виявити по світінню на темному полі. Висока інтенсивність світла, що випромінюється, є характерною особливістю таких молекул. Такий мікроскоп схожий на звичайний оптичний, але світло від потужного освітлювача проходить через два набори фільтрів - один для затримання частини випромінювання освітлювача перед зразком та інший для фільтрації світла, отриманого від зразка. Перший фільтр обраний таким чином, що він пропускає лише світло довжини хвилі, що збуджує певний флуоресцентний барвник; в той же час другий фільтр блокує це падаюче світло і пропускає світло довжини хвилі, що випромінюється барвником при його флуоресценції.

Флуоресцентна мікроскопія часто використовується для виявлення специфічних білків або інших молекул, які стають флуоресцентними після ковалентного зв'язування з флуоресцентними барвниками. Для цієї мети зазвичай використовують два барвники - флуоресцеїн,який дає інтенсивну жовто-зелену флуоресценцію після збудження світло-блакитним світлом, та родамін,що обумовлює темно-червону флуоресценцію після збудження жовто-зеленим світлом. Застосовуючи для фарбування і флюоресцин та родамін можна отримувати розподіл різних молекул.

Темнопільна мікроскопія

Найпростіший спосіб розглянути деталі клітинної структури – спостерігати світло, що розсіюється різними компонентами клітини. У темнопольному мікроскопелі від освітлювача направляються збоку і при цьому в об'єктив мікроскопа потрапляють тільки розсіяні промені. Відповідно клітина виглядає як освітлений об'єкт на темному полі. Однією з основних переваг темнопольної мікроскопії є можливість спостерігати рух клітин у процесі поділу та міграції. Клітинні рухи, як правило, відбуваються дуже повільно і їх складно спостерігати в реальному часі. У цьому випадку використовують покадрову (цейтраферну) мікрокінозйомку або відеозапис. Послідовні кадри при цьому розділені в часі, але при відтворенні з нормальною швидкістю картина реальних подій прискорюється.

В останні роки відеокамери та відповідні технології обробки зображення значно збільшили можливості оптичної мікроскопії. Завдяки їхньому застосуванню вдалося подолати труднощі, зумовлені особливостями фізіології людини. Вони полягають у тому, що:

1. Око у звичайних умовах не реєструє дуже слабке світло.

2. Око не здатне фіксувати невеликі відмінності в інтенсивності світла на яскравому тлі.

Перша з цих проблем була подолана після приєднання до мікроскопа надвисокочутливих відеокамер. Це дозволило спостерігати клітини протягом тривалого часу при низькій освітленості, виключаючи тривалий вплив яскравого світла. Системи обробки зображення особливо важливі вивчення у живих клітинах флуоресцирующих молекул. Оскільки зображення створюється відеокамерою у формі електронних сигналів, його можна відповідним чином перетворити на числові сигнали, направити в комп'ютер і потім піддати додаткової обробки для отримання прихованої інформації.

Високий контраст, досяжний за допомогою комп'ютерної інтерференційної мікроскопії, дозволяє спостерігати дуже дрібні об'єкти, як, наприклад, окремі мікротрубочки, діаметр яких менше однієї десятої довжини хвилі світла (0.025 мкм). Окремі мікротрубочки можна побачити за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Однак в обох випадках неминучі ефекти дифракції, що сильно змінюють зображення. Діаметр мікротрубочок при цьому завищується (0.2 мкм), що не дозволяє відрізняти окремі мікротрубочки від пучка з декількох мікротрубочок. Для вирішення цього завдання необхідний електронний мікроскоп, межа роздільної здатності якого зсунута далеко за межі довжини хвилі видимого світла.

Електронна мікроскопія

Взаємозв'язок довжини хвилі та межі дозволу зберігається і для електронів. Однак для електронного мікроскопа межа дозволу істотно нижча за дифракційну межу. Довжина хвилі електрона зменшується із збільшенням його швидкості. В електронному мікроскопі з напругою 100000 довжина хвилі електрона дорівнює 0.004 нм. Відповідно до теорії, роздільна здатність такого мікроскопа в межі становить 0.002 нм. Однак у реальності внаслідок малої величини числових апертур електронних лінз дозвіл сучасних електронних мікроскопів у разі становить 0,1 нм. Труднощі приготування зразка, його пошкодження випромінюванням суттєво знижують нормальну роздільну здатність, яка для біологічних об'єктів становить 2 нм (приблизно в 100 разів вище, ніж у світлового мікроскопа).

Джерелом електронів у просвічує електронний мікроскоп (ПЕМ)є нитка катода, розташована у вершині циліндричної колони заввишки близько двох метрів. Щоб уникнути розсіювання електронів при зіткненнях із молекулами повітря, у колоні створюється вакуум. Електрони, що випромінюються катодною ниткою, прискорюються найближчим анодом і проникають через крихітний отвір, формуючи електронний промінь, що проходить у нижню частину колони. Уздовж колони на певній відстані розташовані кільцеві магніти, що фокусують електронний промінь, подібно до скляних лінз, фокусуючим промінь світла в оптичному мікроскопі. Зразок через повітряний шлюз поміщають усередину колони на шляху електронного пучка. Частина електронів у момент проходження через зразок розсіюється відповідно до щільності речовини в даній ділянці, залишок електронів фокусується і формує зображення (подібно до формування зображення в оптичному мікроскопі) на фотопластинці або на фосфоресційному екрані.

Одним з найбільших недоліків електронної мікроскопії є те, що біологічні зразки необхідно піддати спеціальній обробці. По-перше, їх фіксують спочатку глутаровим альдегідом, а потім осмієвою кислотою, що зв'язує та стабілізує подвійний шар ліпідів та білків. По-друге, електрони мають низьку проникаючу здатність, тому доводиться робити надтонкі зрізи, а для цього зразки зневоднюють і просочують смолами. По-третє, для посилення розмаїття зразки обробляють солями важких металів, такими як осмій, уран та свинець.

Для того, щоб отримати тривимірне зображення поверхні використовується скануючий електронний мікроскоп (СЕМ), де використовуються електрони, що розсіюються або випромінюються поверхнею зразка. Зразок в даному випадку фіксують, висушують і покривають тонкою плівкою важкого металу, а потім вузьким сканують пучком електронів. При цьому оцінюється кількість електронів, що розсіюються при опроміненні поверхні. Отримане значення використовують для контролю інтенсивності другого променя, що рухається одночасно першому і формує зображення на екрані монітора. Дозвіл методу близько 10 нм і він не застосовується для вивчення внутрішньоклітинних органел. Товщина зразків, що вивчаються цим методом, визначається проникною здатністю електронів або їх енергією.

Основними та суттєвими недоліками всіх цих методів є тривалість, складність та висока вартість приготування зразка.

Сканувальна зондова мікроскопія

У сканувальному зондовому мікроскопі (СЗМ) замість електронного променя або оптичного випромінювання використовується гострий зонд, голка, що сканує поверхню зразка. Образно висловлюючись, можна сказати, що й у оптичному чи електронному мікроскопах зразок оглядається, то СЗМ – обмацується. В результаті можна отримувати тривимірні зображення об'єктів у різних середовищах: вакуумі, повітрі, рідині.

Спеціальні конструкції СЗМ, адаптовані для біологічних досліджень, дозволяють одночасно з оптичним спостереженням сканувати живі клітини в різних рідких середовищах, так і фіксовані препарати на повітрі.

Скануючий зондовий мікроскоп

У назві скануючого зондового мікроскопа відображено принцип його дії - сканування поверхні зразка, при якому здійснюється зчитування поточного ступеня взаємодії зонда з поверхнею. Розмір області сканування та кількість точок у ній N X · N Y можна задавати. Чим більше задається точок, тим з більшою роздільною здатністю виходить зображення поверхні. Відстань між точками зчитування сигналу називається кроком сканування. Крок сканування повинен бути менше деталей поверхні, що вивчаються. Переміщення зонда в процесі сканування (див. мал. 7 -1) здійснюється лінійно у прямому та у зворотному напрямку (у напрямку швидкого сканування), перехід на наступну лінію здійснюється в перпендикулярному напрямку (у напрямку повільного сканування).

Мал. 7 1. Схематичне зображення процесу сканування
(зчитування сигналу здійснюється на прямому ході сканера)

Залежно від характеру зчитуваного сигналу, скануючі мікроскопи мають різні назви та призначення:

атомно-силовий мікроскоп (АСМ), зчитуються сили міжатомної взаємодії між атомами зонда та атомами зразка;

тунельний мікроскоп (СТМ), зчитується тунельний струм, що протікає між провідним зразком і зондом, що проводить;

магнітно-силовий мікроскоп (МФМ), зчитуються сили взаємодії між зондом, покритим магнітним матеріалом, і зразком, що виявляє магнітні властивості;

електростатичний силовий мікроскоп (ЕСМ) дозволяє одержувати картину розподілу електричного потенціалу поверхні зразка. Використовуються зонди, кінчик яких покритий тонкою плівкою (золото або платина).

Конструкція СЗМ

СЗМ складається з наступних основних компонентів (Рис 7 -2): зонда, п'єзоелектричних приводів для переміщення зонда X, Y, Z над поверхнею досліджуваного зразка, ланцюга зворотного зв'язку та комп'ютера для управління процесом сканування та отриманням зображення.

Рис 7 2. Схема скануючого зондового мікроскопа

Зондовий датчик - Компонент силового зондового мікроскопа, що здійснює сканування препарату. Зондовий датчик містить кантилевер (пружинну консоль) прямокутного (I-подібного) або трикутного (V-подібного) типів (Мал. 7 -3), на кінці якого розміщений гострий зонд (Мал. 7 -3), що має зазвичай конусну або пірамідальну форму . Іншим кінцем кантилевер стикується з підкладкою (з так званим чіпом). Зондові датчики виготовляються із кремнію або нітриду кремнію. Основною характеристикою кантилевера є силова константа (константа жорсткості), вона варіюється від 0.01 N/m до 1020 N/m. Для досліджень біологічних об'єктів використовуються “м'які” зонди із жорсткістю 0.01  0.06 N/m.

Мал. 7 3. Зображення пірамідальних АСМ зондових датчиків
отримане за допомогою електронного мікроскопа:
а – I-подібний тип, б – V-подібний тип, с – пірамідка на кінчику кантилевера

П'єзоелектричні приводи або сканери - для контрольованого переміщення зонда над зразком чи самого зразка щодо зонда на надмалих відстанях. У п'єзоелектричних приводах використовують п'єзокерамічні матеріали, які змінюють свої розміри при додатку до них електричної напруги. Процес зміни геометричних параметрів під впливом електричного поля називається зворотним пьезоэффектом. Найбільш поширений п'єзоматеріал – цирконат-титанат свинцю.

Сканер - конструкція з п'єзокераміки, що забезпечує переміщення за трьома координатами: x, y (у латеральній площині зразка) та z (по вертикалі). Існує кілька типів сканерів, найбільш поширеними з яких є трипідні та трубчасті (Рис. 7 -4).

Мал. 7 4. Конструкції сканерів: а) – трипідний; б) – трубчастий

У триподном сканері переміщення за трьома координатами забезпечують утворюють ортогональну структуру три незалежні п'єзокерамічні стрижні.

У трубчастому сканері порожниста п'єзоелектрична трубка згинається в площинах XZ і ZY і подовжується або стискається по осі Z при подачі відповідних напруг на електроди, що керують переміщеннями трубки. Електроди для управління рухом у площині XY розташовані на зовнішній поверхні трубки, для управління переміщенням Z на X і Y електроди подаються рівні напруги.

Ланцюг зворотного зв'язку - Сукупність елементів СЗМ, за допомогою якої при скануванні зонд утримується на фіксованій відстані від поверхні зразка (Рис. 7 -5). У процесі сканування зонд може перебувати на ділянках поверхні зразка з різним рельєфом, при цьому змінюватиметься відстань Z зонд-зразок, відповідно буде змінюватися і величина взаємодії зонд-зразок.

Мал. 7 5. Схема зворотного зв'язку скануючого зондового мікроскопа

При наближенні зонда до поверхні зростають сили взаємодії зонд-зразок, зростає сигнал реєструючого пристрою. V(t), Котрий виявляється у одиницях напруги. Компаратор порівнює сигнал V(t) з опорною напругою V опорнета виробляє коригуючий сигнал V корр. Сигнал корекції V коррподається на сканер і зонд відводиться від зразка. Опорна напруга – напруга, що відповідає сигналу реєструючого пристрою, коли зонд виявляється на заданій відстані від зразка. Підтримуючи в процесі сканування цю відстань зонд-зразок, система зворотного зв'язку підтримує задану силу взаємодії зонд-зразок.

Мал. 7 6. Траєкторія відносного руху зонда в процесі підтримки системою зворотного зв'язку постійної сили взаємодії зонд-зразок

Рис. 7 -6 показано траєкторію руху зонда щодо зразка при збереженні постійної сили взаємодії зонд-зразок. Якщо зонд виявляється над ямкою, на сканер подається напруга, коли сканер подовжується, опускаючи зонд.

Швидкість відгуку ланцюга зворотного зв'язку зміну відстані зонд-зразок (взаємодії зонд-зразок) визначається константою ланцюга зворотний зв'язок K. Значення Kзалежать від особливостей конструкції конкретного СЗМ (конструкції та характеристик сканера, електроніки), режиму роботи СЗМ (розміру області сканування, швидкості сканування тощо), а також особливостей поверхні, що досліджується (масштабу особливостей рельєфу, твердості матеріалу тощо).

Різновиди СЗМ

Скануючий тунельний мікроскоп

У СТМ реєструючим пристроєм (Мал. 7 -7) вимірюється тунельний струм, що протікає між металевим зондом, який змінюється в залежності від потенціалу на поверхні зразка та від рельєфу його поверхні. Зонд є гострою заточеною голкою, радіус закруглення вістря якої може досягати декількох нанометрів. Як матеріал для зонда зазвичай використовуються метали з високою твердістю та хімічною стійкістю: вольфрам або платина.

Мал. 7 7. Схема тунельного зондового датчика

Між зондом і провідним зразком прикладається напруга. Коли кінчик зонда виявляється з відривом близько 10А від зразка, електрони із зразка починають тунелювати через проміжок у зонд чи навпаки, залежно від знака напруги (Рис. 7 -8).

Мал. 7 8. Схематичне зображення взаємодії кінчика зонда із зразком

Тунельний струм, що виникає при цьому, вимірюється реєструючим пристроєм. Його величина I Тпропорційна доданій до тунельного контакту напруги Vта експоненційно залежить від відстані від голки до зразка d.

Таким чином, малим змінам відстані від кінчика зонда до зразка dвідповідають експоненційно великі зміни тунельного струму I Т(передбачається, що напруга Vпідтримується незмінним). Внаслідок цього чутливість тунельного зондового датчика достатня, щоб зареєструвати зміни висот менше 0,1 нм, і, отже, отримати зображення атомів на поверхні твердого тіла.

Атомно-силовий мікроскоп

Найбільш поширеним зондовим датчиком атомно-силової взаємодії є пружинний кантилевер (від англ. Cantilever - консоль) з розташованим на його кінці зондом. Розмір вигину кантилевера, що виникає внаслідок силової взаємодії між зразком і зондом (Рис 7 -9), вимірюється за допомогою оптичної схеми реєстрації.

Принцип дії силового датчика ґрунтується на використанні атомних сил, що діють між атомами зонда та атомами зразка. При зміні сили зонд-зразок змінюється величина вигину кантильовера, і така зміна вимірюється оптичною системою реєстрації. Таким чином, атомно-силовий датчик є гострий зонд з високою чутливістю, що дозволяє реєструвати сили взаємодії між окремим атомами.

При малих вигинах співвідношення між силою зонд-зразок Fі відхиленням кінчика кантилевери xвизначається законом Гука:

де k - Силова константа (константа жорсткості) кантилевера.

Наприклад, якщо використовується кантилевер з константою kпорядку 1 н/м, то під дією сили взаємодії зонд-зразок порядку 0.1 наноньютона величина відхилення кантилевера складе приблизно 0.1 нм.

Для вимірювання таких малих переміщень зазвичай використовується оптичний датчик зсувів (Рис 7 -9), що складається з напівпровідникового лазера і чотирисекційного фотодіода. При згинанні кантилевера відбитий від нього промінь лазера зміщується щодо центру фотодетектора. Таким чином, вигин кантилевера може бути визначений відносною зміною освітленості верхньої (T) і нижньої (B) половинок фотодетектора.

Рис 7 9. Схема силового датчика

Залежність сил взаємодії зонд-зразок від відстані зонд-зразок

При наближенні зонда до зразка він спочатку притягується до поверхні завдяки наявності сил, що притягають (сили Ван-дер-Ваальса). При подальшому наближенні зонда до зразка електронні оболонки атомів на кінці зонда та атомів на поверхні зразка починають перекриватися, що призводить до появи сили, що відштовхує. При подальшому зменшенні відстані сила, що відштовхує, стає домінуючою.

Загалом залежність сили міжатомної взаємодії Fвід відстані між атомами Rмає вигляд:

.

Константи aі bта показники ступеня mі nзалежать від сорту атомів та типу хімічних зв'язків. Для сил Ван-дер-Ваальса m=7 та n=3. Якісно залежність F(R) показано на Рис. 7-10.

Мал. 7 10. Залежність сили взаємодії між атомами від відстані

Формат СЗМ – даних, візуалізація СЗМ – даних

Дані про морфологію поверхні, отримані для дослідження на оптичному мікроскопі, подаються у вигляді збільшеного зображення ділянки поверхні. Інформація, що отримується за допомогою СЗМ, записується у вигляді двовимірного масиву цілих чисел A ij . Кожному значенню ij відповідає певна точка поверхні у межах поля сканування. Графічне відображення цього масиву чисел називається СЗМ сканованим зображенням.

Скановані зображення можуть бути двовимірними (2D), так і тривимірними (3D). При 2D візуалізації кожної точки поверхні Z= f(x,y) ставиться у відповідність певний колірний тон відповідно до висоти точки поверхні (Рис. 7 -11 а). При 3D візуалізації зображення поверхні Z= f(x,y) будується в аксонометрической перспективі з допомогою певним чином розрахованих пікселів чи ліній рельєфу. Найбільш ефективним способом розмальовки 3D зображень є моделювання умов підсвічування поверхні точковим джерелом, розташованим у певній точці простору над поверхнею (рис. 7-11 б). У цьому вдається підкреслити окремі малі особливості рельєфу.

Мал. 7 11. Лімфоцити крові людини:
а) 2D-зображення; б) 3D зображення з бічним підсвічуванням

Підготовка зразків для СЗМ дослідження

Морфологія та структура бактеріальних клітин

Бактерії – одноклітинні мікроорганізми, що мають різноманітну форму та складну структуру, що визначає різноманіття їх функціональної діяльності. Для бактерій характерні чотири основні форми: сферична (куляста), циліндрична (паличкоподібна), звивиста і ниткоподібна [Літ. 7-2].

Кокі (бактерії кулястої форми) – залежно від площини поділу та розташування окремих особин поділяються на мікрококи (окремо лежачі коки), диплококи (парні коки), стрептококи (ланцюжки коків), стафілококи (що мають вид виноградних грон), тетракоки (утворення) ) та сарцини (пакети з 8 або 16 коків).

Паличкоподібні – бактерії розташовуються у вигляді одиночних клітин, дипло-або стрептобактерій.

Покручені – вібріони, спірили та спірохети. Вібріони мають вигляд злегка вигнутих паличок, спірили – звивисту форму з кількома спіральними завитками.

Розміри бактерій коливаються від 0,1 до 10 мкм. До складу бактеріальної клітини входять капсула, клітинна стінка, цитоплазматична мембрана та цитоплазма. У цитоплазмі знаходяться нуклеотид, рибосоми та включення. Деякі бактерії забезпечені джгутиками та ворсинками. Ряд бактерій утворюють суперечки. Перевищуючи вихідний поперечний розмір клітини, суперечки надають їй веретеноподібної форми.

Для вивчення морфології бактерій на оптичному мікроскопі їх готують нативні (прижиттєві) препарати чи фіксовані мазки, пофарбовані аніліновим барвником. Існують спеціальні методи фарбування для виявлення джгутиків, клітинної стінки, нуклеотиду та різних цитоплазматичних включень.

Для СЗМ дослідження морфології бактеріальних клітин не потрібно забарвлення препарату. СЗМ дозволяє з високим ступенем дозволу визначити форму та розмір бактерій. При ретельному приготуванні препарату та використанні зонда з малим радіусом закруглення можливе виявлення джгутиків. У той же час через велику жорсткість клітинної стінки бактерій не можна «промацати» внутрішньоклітинні структури, як це можна зробити на деяких тваринних клітинах.

Приготування препаратів для СЗМ вивчення морфології

Для першого досвіду роботи із СЗМ рекомендується вибрати біологічний препарат, який не потребує складної підготовки. Цілком підійдуть легкодоступні та непатогенні кисломолочні бактерії з розсолу квашеної капусти або кисломолочних продуктів.

Для СЗМ дослідження на повітрі потрібно міцно зафіксувати об'єкт, що досліджується, на поверхні підкладки, наприклад, на покривному склі. Крім того, щільність бактерій у суспензії повинна бути такою, щоб клітини при осадженні на підкладку не злипалися, і відстань між ними була не надто велика, щоб при скануванні можна було в один кадр взяти кілька об'єктів. Ці умови виконуються, якщо правильно вибрати режим приготування зразка. Якщо нанести краплю розчину, що містить бактерії, на підкладку, то відбуватиметься їх поступове осадження та адгезія. Основними параметрами при цьому слід вважати концентрацію клітин у розчині та час осадження. Концентрацію бактерій у суспензії визначають за оптичним стандартом каламутності.

У разі роль гратиме лише одне параметр – час інкубації. Чим довше витримувати краплю на склі, тим більше виявиться щільність бактеріальних клітин. У той же час, якщо крапля рідини почне підсихати, то препарат буде занадто сильно забруднений компонентами розчину, що осадилися. Краплю розчину, що містить бактеріальні клітини (розсіл), наносять на покривне скло, витримують 5-60 хвилин (залежно від складу розчину). Потім, не чекаючи висихання краплі, ретельно промивають дистильованою водою (обмокуючи препарат пінцетом у склянку кілька разів). Після висушування препарат готовий для вимірювання СЗМ.

Для прикладу приготували препарати кисломолочних бактерій із розсолу квашеної капусти. Час витримування краплі розсолу на покривному склі вибрали 5 хв, 20 хв та 1 годину (крапля вже почала підсихати). СЗМ – кадри представлені на Мал. 7-12, Мал. 7 -13,
Мал. 7-14.

З малюнків видно, що з даного розчину оптимальний час інкубації 510 хв. Збільшення часу витримування краплі поверхні підкладки призводить до злипання бактеріальних клітин. У разі, коли крапля розчину починає підсихати, спостерігається осадження на скло компонентів розчину, які неможливо відмити.

Мал. 7 12. Зображення кисломолочних бактерій на покривному склі,
отримані за допомогою СЗМ.

Мал. 7 13. Зображення кисломолочних бактерій на покривному склі,
отримані за допомогою СЗМ. Час інкубації розчину 20 хв.

Мал. 7 14. Зображення кисломолочних бактерій на покривному склі,
отримані за допомогою СЗМ. Час інкубації розчину 1 год.

На одному з відібраних препаратів (Рис. 7 -12) ми постаралися розглянути, що ж є кисломолочними бактеріями, яка форма для них характерна в даному випадку. (Мал. 7 -15)

Мал. 7 15. АСМ – зображення кисломолочних бактерій на покривному склі.
Час інкубації розчину 5 хв.

Мал. 7 16. АСМ – зображення ланцюжка кисломолочних бактерій на покривному склі.
Час інкубації розчину 5 хв.

Для розсолу характерна форма бактерій паличкоподібної форми та розташування у вигляді ланцюжка.

Мал. 7 17. Вікно керуючої програминавчального ЗЗМ NanoEducator.
Панель інструментів

Використовуючи інструменти програми навчального СЗМ NanoEducator ми визначили розміри бактеріальних клітин. Вони склали приблизно від 0.5×1.6 мкм
до 0.8×3.5 мкм.

Отримані результати можна порівняти з даними, наведеними у визначнику бактерій Берджі [Літ. 7-3].

Кисломолочні бактерії відносяться до лактобактерій (Lactobacillus). Клітини мають вигляд паличок, зазвичай правильної форми. Палички довгі, іноді майже кокоподібні, зазвичай у коротких ланцюжках. Розміри 0,5 – 1,2 Х 1,0 – 10 мкм. Суперечка не утворюють; в поодиноких випадках рухливі за рахунок перитрихіальних джгутиків. Широко поширені у навколишньому середовищі, особливо часто зустрічаються у харчових продуктах тваринного та рослинного походження. Кисломолочні бактерії входять до нормальної мікрофлори травного тракту. Всім відомо, що квашена капуста, крім вмісту в ній вітамінів, корисна для покращення мікрофлори кишківника.

Конструкція скануючого зондового мікроскопа NanoEducator

Рис. 7 -18 представлений зовнішній вигляд вимірювальної головки СЗМ NanoEducatorта позначені основні елементи приладу, що використовуються під час роботи.

Мал. 7 18. Зовнішній виглядвимірювальної головки СЗМ NanoEducator
1- основа, 2-тримач зразка, 3- Датчик взаємодії, 4-гвинт фіксації датчика,
5-гвинт ручного підведення, 6-гвинти переміщення сканера із зразком у горизонтальній площині, 7-захисна кришка з відеокамерою

Рис. 7 -19 представлена ​​конструкція вимірювальної головки. На підставі 1 розташовані сканер 8 з тримачем зразка 7 механізм підведення зразка до зонда 2 на основі крокового двигуна. У навчальному СЗМ NanoEducatorзразок закріплюється на сканер і здійснюється сканування зразком щодо нерухомого зонда. Підведення зонда 6, закріпленого на датчику силової взаємодії 4, до зразка можна здійснювати за допомогою гвинта ручного підведення 3. Попередній вибір місця дослідження на зразку здійснюється за допомогою гвинта 9.

Мал. 7 19. Конструкція СЗМ NanoEducator: 1 – основа, 2 – механізм підведення,
3 – гвинт ручного підведення, 4 – датчик взаємодії, 5 – гвинт фіксації датчика, 6 – зонд,
7 – тримач зразка, 8 – сканер, 9, 10 – гвинти переміщення сканера із зразком

Навчальний СЗМ NanoEducatorскладається із з'єднаних кабелями вимірювальної головки, СЗМ контролера та керуючого комп'ютера. Мікроскоп має відеокамеру. Сигнал від датчика взаємодії після перетворення в підсилювачі надходить у СЗМ контролер. Управління роботою СЗМ NanoEducatorздійснюється від комп'ютера через СЗМ контролер.

Датчик силової взаємодії та зонд

У приладі NanoEducatorдатчик виконаний у вигляді п'єзокерамічної трубки завдовжки l=7 мм, діаметром d=1,2 мм та товщиною стінки h=0,25 мм, жорстко закріпленої з одного кінця. На внутрішню поверхню трубки нанесений провідний електрод. На зовнішню поверхню трубки нанесені два електрично ізольовані напівциліндричні електроди. До вільного кінця трубки прикріплено вольфрамовий дріт діаметром
100 мкм (Мал. 7 -20).

Мал. 7 20. Конструкція універсального датчика приладу NanoEducator

Вільний кінець дроту, що використовується як зонд, заточений електрохімічно, радіус закруглення має величину 0.2  0.05 мкм. Зонд має електричний контакт із внутрішнім електродом трубки, з'єднаним із заземленим корпусом приладу.

Наявність двох зовнішніх електродів на п'єзоелектричній трубці дозволяє як датчик силової взаємодії (датчика механічних коливань) використовувати одну частину п'єзоелектричної трубки (верхню, відповідно до Рис. 7 -21), а іншу частину використовувати як п'єзовібратор. До п'єзовібратора підводиться змінна електрична напруга з частотою, що дорівнює резонансній частоті силового датчика. Амплітуда коливань при великій відстані зонд-зразок максимальна. Як видно з Мал. 7 -22, у процесі коливань зонд відхиляється від рівноважного становищана величину А, рівну амплітуді його вимушених механічних коливань (вона становить частки мікрометра), при цьому на другій частині п'єзрубки (датчику коливань) виникає змінна електрична напруга, пропорційна зсуву зонда, яке і вимірюється приладом.

При наближенні зонда до поверхні зразка зонд починає торкатися зразка у процесі коливань. Це призводить до усунення амплітудно-частотної характеристики (АЧХ) коливань датчика вліво порівняно з АЧХ, виміряної далеко від поверхні (Рис. 7 -22). Так як частота вимушують коливань п'єзрубки підтримується постійною і рівною частоті коливань  у вільному стані, то при наближенні зонда до поверхні амплітуда його коливань зменшується і стає рівною A. Ця амплітуда коливань реєструється з другої частини п'єзрубки.

Мал. 7 21. Принцип роботи п'єзоелектричної трубки
як датчик силової взаємодії

Мал. 7 22. Зміна частоти коливань силового датчика
при наближенні до поверхні зразка

Сканер

Спосіб організації мікропереміщень, що використовується у приладі NanoEducator, заснований на використанні затиснутої по периметру металевої мембрани, до поверхні якої приклеєна п'єзопластинка (Мал. 7 -23 а). Зміна розмірів п'єзопластинки під дією напруги, що управляє, буде призводити до вигину мембрани. Розташувавши такі мембрани по трьох перпендикулярних сторонах куба і з'єднавши їх центри металевими штовхачами, можна отримати 3 х -координатний сканер (Рис. 7 -23 б).

Мал. 7 23. Принцип дії (а) та конструкція (б) сканера приладу NanoEducator

Кожен п'єзоелемент 1, закріплений на гранях куба 2, при додатку до нього електричної напруги може пересувати прикріплений до нього штовхач 3 в одному з трьох взаємно перпендикулярних напрямків - X, Y або Z. Як видно з малюнка, всі три штовхачі з'єднані в одній точці 4 .З деяким наближенням можна вважати, що ця точка переміщається за трьома координатами X, Y, Z . До цієї точки прикріплюється стійка 5 з тримачем зразка 6. Таким чином, зразок переміщається по трьох координат під дією трьох незалежних джерел напруги. У приладах NanoEducatorмаксимальне переміщення зразка становить близько 5070 мкм, що і визначає максимальну площу сканування.

Механізм автоматизованого підведення зонда до зразка (захоплення зворотного зв'язку)

Діапазон переміщень сканера осі Z становить близько 10 мкм, тому перед початком сканування необхідно наблизити зонд до зразка на цю відстань. Для цього призначений механізм підведення, схема якого наведена на Рис. 7-19. Кроковий двигун 1 при подачі на нього електричних імпульсів обертає гвинт подачі 2 і переміщає планку 3 з зондом 4, наближаючи або віддаляючи від зразка 5, встановленого на сканері 6. Величина одного кроку становить близько 2 мкм.

Мал. 7 24. Схема механізму підведення зонда до поверхні зразка

Оскільки крок механізму підведення значно перевищує величину необхідної відстані зонд-зразок у процесі сканування, те щоб уникнути деформації зонда його підведення здійснюється за одночасної роботі крокового двигуна і переміщенням сканера по осі Z за наступним алгоритмом:

1. Система зворотного зв'язку відключається і сканер "втягується", тобто опускає зразок у нижнє крайнє положення.

2. Механізм підведення зонда робить один крок і зупиняється.

3. Система зворотного зв'язку включається, і сканер плавно піднімає зразок, одночасно проводиться аналіз взаємодії зонд-зразок.

4. Якщо відсутня взаємодія, процес повторюється з пункту 1.

Якщо під час витягування сканера вгору з'явиться ненульовий сигнал, система зворотного зв'язку зупинить рух сканера вгору та зафіксує величину взаємодії на заданому рівні. Величина силової взаємодії, при якій відбудеться зупинка підведення зонда і відбуватиметься процес сканування, у приладі NanoEducatorхарактеризується параметром Придушення амплітуди (AmplitudeSuppression) :

A = A o . (1- Amplitude Suppression)

Отримання СЗМ-зображення

Після виклику програми NanoEducatorна екрані комп'ютера з'являється головне вікно програми (Мал. 7-20). Роботу слід розпочати з пункту меню Файлі в ньому вибрати Відкритиабо новийабо відповідні кнопки на панелі інструментів (, ).

Вибір команди Файл новийозначає перехід до проведення СЗМ вимірів, а вибір команди Файл Відкритиозначає перехід до перегляду та обробки раніше отриманих даних. Програма дозволяє здійснювати перегляд та обробку даних паралельно з вимірами.

Мал. 7 25. Головне вікно програми NanoEducator

Після виконання команди Файл новийна екрані з'являється діалогове вікно, яке дозволяє вибрати або створити робочу папку, в який за замовчуванням будуть записуватися результати поточного вимірювання. У процесі проведення вимірювань усі отримані дані послідовно записуються у файли з іменами ScanData+i.spm, де індекс iобнулюється при запуску програми та нарощується при кожному новому вимірі. Файли ScanData+i.spmпоміщаються у робочу папку, що встановлюється перед початком вимірів. Існує можливість вибору іншої робочої папкипід час проведення вимірів. Для цього потрібно натиснути кнопку , розташовану на панелі інструментів головного вікна програми та вибрати пункт меню Змінити робочу папку.

Для збереження результатів поточного виміру необхідно натиснути кнопку Зберегти яку вікні сканування у вікні діалогу вибрати папку і вказати ім'я файлу, при цьому файл ScanData+i.spm, який служить тимчасовим файлом збереження даних у процесі проведення вимірювань, буде перейменовано на вказане ім'я файлу. За промовчанням файл буде збережено у робочій папці, призначеній перед початком вимірювань. Якщо не виконати операцію збереження результатів вимірювань, то під час наступного запуску програми результати, записані у тимчасових файлах ScanData+i.spm, будуть послідовно перезаписуватись (якщо не змінено робочу папку). Про наявність тимчасових файлів результатів вимірювань у робочій папці видається попередження перед закриттям та після запуску програми. Зміна робочої папки перед проведенням вимірювань дозволяє захистити результати попереднього експерименту від видалення. Стандартне ім'я ScanDataможна змінити, задавши його у вікні вибору робочої папки. Виклик вікна вибору папки відбувається при натисканні кнопки , розташована на панелі інструментів головного вікна програми. Зберегти результати вимірювань можна також у вікні Браузер сканів, по черзі виділяючи необхідні файлита зберігаючи їх у вибраній папці.

Існує можливість експорту результатів, отриманих за допомогою приладу NanoEducator в формат ASCII і формат Nova (фірма НТМДТ), який може бути імпортований програмою НТ МДТ Nova, Image Analysis та іншими програмами. У формат ASCII експортуються зображення сканів, дані їх перерізів, результати вимірювання спектроскопії. Для експорту даних потрібно натиснути кнопку Експорт, розташовану в інструментальній панелі головного вікна програми, або вибрати Експорту пункті меню Файлцього вікна та вибрати відповідний формат експорту. Дані для обробки та аналізу можна відразу надіслати до попередньо запущеної програми Image Analysis.

Після закриття вікна діалогу на екран виводиться панель керування приладом
(Мал. 7 -26).

Мал. 7 26. Панель керування приладом

У лівій частині панелі керування приладом розташовані кнопки вибору конфігурації СЗМ:

ССМ- Скануючий силовий мікроскоп (ССМ)

СТМ- Скануючий тунельний мікроскоп (СТМ).

Проведення вимірів на навчальному СЗМ NanoEducator полягає у виконанні наступних операцій:

1. Встановлення зразка

УВАГА! Перед встановленням зразка необхідно зняти датчик із зондом, щоб не пошкодити зонд.

Передбачено два способи кріплення зразка:

на магнітному столику (у цьому випадку зразок має бути прикріплений до магнітної підкладки);

на двосторонній липкій стрічці.

УВАГА! Для встановлення зразка на двосторонній липкій стрічці, необхідно викрутити тримач зі стійки (щоб не пошкодити сканер), а потім знову вкрутити його до легкого упору.

У разі магнітного кріплення заміна зразка може виконуватися без відгвинчування утримувача зразка.

2. Встановлення зондового датчика

УВАГА! Встановлювати датчик із зондом слід завжди після встановлення зразка.

Вибравши потрібний зондовий датчик (тримайте датчик за металеві кромки основи) (див. Мал. 7 -27), послабте гвинт фіксації зондового датчика 2 на кришці вимірювальної головки, вставте датчик у гніздо тримача до упору, закрутіть гвинт фіксації за годинниковою стрілкою до легкого .

Мал. 7 27. Встановлення зондового датчика

3. Вибір місця сканування

При виборі на зразку ділянки дослідження використовуйте гвинти переміщення двокоординатного столика, розташованого в нижній частині приладу.

4. Попереднє підведення зонда до зразка

Операція попереднього підведення не є обов'язковою для кожного виміру, необхідність її виконання залежить від величини відстані між зразком і вістрям зонда. Операцію попереднього зближення бажано проводити, якщо відстань між кінчиком зонда та поверхнею зразка перевищує 0.51 мм. При використанні автоматизованого підведення зонда до зразка з великої відстані між ними процес підведення займе багато часу.

Скористайтеся гвинтом ручного підведення для опускання зонда, контролюючи відстань між ним та поверхнею зразка візуально.

5. Побудова резонансної кривої та встановлення робочої частоти

Ця операція обов'язково виконується на початку кожного виміру і, доки вона не зроблена, перехід до подальших етапів вимірів заблокований. Крім того, у процесі вимірювань іноді виникають ситуації, що вимагають повторного виконання цієї операції (наприклад, у разі втрати контакту).

Вікно пошуку резонансу викликається натисканням кнопки на панелі керування приладом. Виконання цієї операції передбачає вимірювання амплітуди коливань зонда при зміні частоти вимушених коливань, що задаються генератором. Для цього потрібно натиснути кнопку RUN(Мал. 7 -28).

Мал. 7 28. Вікно операції пошуку резонансу та встановлення робочої частоти:
а) – автоматичний режим; б) – ручний режим.

В режимі Автоавтоматично встановлюється частота генератора, що дорівнює частоті, при якій спостерігалася максимальна амплітуда коливань зонда. Графік, що демонструє зміну амплітуди коливань зонда в заданому діапазоні частот (Рис. 7 -28а), дозволяє спостерігати форму резонансного піку. Якщо резонансний пік недостатньо яскраво виражений, або амплітуда при частоті резонансу мала ( менше 1В), то необхідно змінити параметри проведення вимірювань та повторно провести визначення резонансної частоти.

Для цього призначено режим Ручний. При виборі цього режиму у вікні Визначення резонансної частотиз'являється додаткова панель
(Мал. 7 -28б), що дозволяє коригувати такі параметри:

Напруга розгойдування зонда, що задаються генератором. Рекомендується встановлювати цю величину мінімальної (аж до нуля) та не більше 50 мВ.

Коефіцієнт посилення амплітуди ( Посилення амплітуди). При недостатній величині амплітуди коливань зонда (<1 В) рекомендуется увеличить коэффициент Посилення амплітуди.

Для початку операції пошуку резонансу необхідно натиснути кнопку Старт.

Режим Ручнийдозволяє вручну змінювати вибрану частоту, пересуваючи зелений курсор на графіку за допомогою миші, а також уточнити характер зміни амплітуди коливань у вузькому діапазоні значень навколо вибраної частоти (для цього необхідно встановити перемикач Ручний режиму становище Точнота натиснути кнопку Старт).

6. Захоплення взаємодії

Для захоплення взаємодії виконується процедура контрольованого зближення зонда та зразка за допомогою механізму автоматизованого підведення. Вікно керування цією процедурою викликається натисканням кнопки на панелі керування приладом. Під час роботи з ССМ ця кнопка стає доступною після виконання операції пошуку та встановлення резонансної частоти. Вікно ССМ, Підведення(Мал. 7 -29) містить елементи керування підведенням зонда, а також індикації параметрів, які дозволяють аналізувати процес виконання процедури.

Мал. 7 29. Вікно процедури підведення зонда

У вікні Підведеннякористувач має можливість спостерігати за такими величинами:

подовженням сканера ( СканерZ) по осі Z щодо максимально можливої, прийнятої за одиницю. Величина відносного подовження сканера характеризується рівнем заповнення лівого індикатора кольором, що відповідає зоні, в якій знаходиться сканер в даний момент: зелений колір – робоча зона, синій – поза робочою зоною, червоний – сканер підійшов надто близько до поверхні зразка, що може спричинити деформацію зонда. У разі програма видає звукове попередження;

амплітудою коливань зондащодо амплітуди його коливань без силової взаємодії, прийнятої за одиницю. Величина відносної амплітуди коливань зонда показана правому індикаторі рівнем його заповнення бордовим кольором. Горизонтальна мітка на індикаторі Амплітудою коливань зондавказує на рівень, при переході через який проводиться аналіз стану сканера та його автоматичне виведення в робоче положення;

кількість кроків ( Шагі), пройдених у заданому напрямку: Підведення – зближення, Відведення – видалення.

До початку процесу опускання зонда необхідно:

Перевірити правильність установок параметрів зближення:

Коефіцієнт посилення ланцюга зворотний зв'язок Посилення ОСвстановлений на значенні 3 ,

Переконайтеся, що параметр Придушенняамплітуди (Сила)має величину близько 0,2 (див. мал. 7 -29). В іншому випадку натиснути кнопку Силаі у вікні Встановлення параметрів взаємодії (Рис. 7-30)встановити значення Придушенняамплітудирівне 0.2. Для більш делікатного підведення значення параметра Придушенняамплітудиможе бути менше .

Перевірити правильність установок у вікні параметрів Параметри, сторінка Параметри підведення.

Є взаємодія чи ні, можна визначити за лівим індикатором СканерZ. Повне подовження сканера (весь індикатор СканерZпофарбований синім кольором), а також повністю зафарбований бордовим кольором індикатор Амплітуда коливань зонда(Мал. 7 -29) вказують на відсутність взаємодії. Після виконання пошуку резонансу та встановлення робочої частоти амплітуда вільних коливань зонда приймається за одиницю.

Якщо ж сканер подовжено не повністю або під час зближення, або програма видає повідомлення: 'Помилка! Зонд дуже близький до зразка. Перевірте параметри підведення чи фізичний вузол. Ви хочете відійти в безпечне місце", то рекомендується призупинити виконання процедури підведення та:

a. змінити один із параметрів:

збільшити величину взаємодії, параметр Придушенняамплітуди, або

збільшити значення Посилення ОС, або

збільшити час затримки між кроками зближення (параметр Час інтегруванняна сторінці Параметри підведеннявікна Параметри).

b. збільшити відстань між вістрям зонда та зразком (для цього виконати дії, описані в пункті та виконати операцію Резонанс, після чого повернутися до виконання процедури Підведення.

Мал. 7 30. Вікно встановлення величини взаємодії зонда та зразка

Після захоплення взаємодії з'являється повідомлення “ Підведення виконане”.

При необхідності здійснити зближення на один крок слід натиснути кнопку . У цьому випадку спочатку виконується крок, а потім здійснюється перевірка критеріїв захоплення взаємодії. Для зупинки руху необхідно натиснути кнопку . Для виконання операції відведення необхідно натиснути кнопку для швидкого відведення

або натиснути кнопку для повільного відведення. При необхідності здійснити відведення на один крок слід натиснути кнопку . У цьому випадку спочатку виконується крок, а потім здійснюється перевірка критеріїв захоплення взаємодії

7. Сканування

Після виконання процедури підведення ( Підведення) та захоплення взаємодії стає доступним сканування (кнопка у вікні панелі керування приладом).

Натиснувши цю кнопку (вигляд вікна сканування представлений на Рис. 7 -31), користувач приступає безпосередньо до проведення вимірювань та отримання результатів вимірювань.

Перед скануванням необхідно встановити параметри сканування. Ці параметри згруповані у правій частині верхньої панелі вікна Сканування.

Вперше після запуску програми вони встановлюються за замовчуванням:

Площа сканування - Область (Xнм*Yнм): 5000*5000 нм;

Кількість точоквимірювань по осях- X, Y: NX=100, NY=100;

Шлях сканування - Напрямвизначає напрямок сканування. Програма дозволяє вибирати напрямок осі швидкого сканування (Х або Y). Під час запуску програми встановлюється Напрям

Після встановлення параметрів сканування необхідно натиснути кнопку Застосуватидля підтвердження введення параметрів та кнопки Стартдля початку сканування.

Мал. 7 31. Вікно управління процесом та відображення результатів сканування ССМ

7.4.Методичні вказівки

Перш ніж розпочати роботу на сканувальному зондовому мікроскопі NanoEducator слід вивчити посібник користувача приладу [Лит. 7-4].

7.5.Техніка безпеки

Для живлення приладу використовується напруга 220 В. Експлуатацію скануючого зондового мікроскопа NanoEducator проводити відповідно до ПТЕ та ПТБ електроустановок споживачів напругою до 1000 В.

7.6.Завдання

1. Підготуйте самостійно біологічні зразки для досліджень методом СЗМ.

2. Вивчіть практично загальну конструкцію приладу NanoEducator.

3. Ознайомтеся з програмою керування приладом NanoEducator.

4. Отримайте перше СЗМ зображення під контролем викладача.

5. Проведіть обробку та аналіз отриманого зображення. Які форми бактерій притаманні вашому розчину? Чим визначається форма та розміри бактеріальних клітин?

6. Візьміть Визначник бактерій Берджі та порівняйте отримані результати з описаними там.

7.7.Контрольні питання

1. Які методи дослідження біологічних об'єктів?

2. Що таке скануюча зондова мікроскопія? Який принцип лежить у її основі?

3. Назвіть основні компоненти СЗМ та їх призначення.

4. Що таке п'єзоелектричний ефект і як він застосовується у СЗМ. Опишіть різні конструкції сканерів.

5. Опишіть загальну конструкцію приладу NanoEducator.

6. Опишіть датчик силової взаємодії та принцип його дії.

7. Опишіть механізм підведення зонда до зразка у приладі NanoEducator. Поясніть параметри, що визначають силу взаємодії зонда із зразком.

8. Поясніть принцип сканування та роботи системи зворотного зв'язку. Розкажіть про критерії вибору параметрів сканування.

7.8.Література

Літ. 7 1. Поль де Крюї. Мисливці за бактеріями. М. Терра. 2001.

Літ. 7 2. Посібник до практичних занять з мікробіології. За ред Єгорова Н.С. М: Наука, 1995.

Літ. 7 3. Хоулт Дж., Кріг Н., П. Сніт, Дж. Стейлі, С. Вільямс. // Визначник бактерій Берджі. М.: Світ, 1997. Т. № 2. C. 574.

Літ. 7 4. Посібник користувача приладу NanoEducator.об'єктів. Нижній Новгород. Науково-освітній центр...

Скануючий зондовий мікроскоп

Найбільш молодий і водночас перспективний напрямок у дослідженні властивостей поверхні – скануюча зондова мікроскопія. Зондові мікроскопи мають рекордну роздільну здатність – менше 0,1 нм. Вони можуть виміряти взаємодію між поверхнею і скануючим її мікроскопічним вістрям - зондом - і виводять тривимірне зображення на екран комп'ютера.

Методи зондової мікроскопії дозволяють як бачити атоми і молекули, а й впливати ними. При цьому – що особливо важливо – об'єкти можуть вивчатися не обов'язково у вакуумі (що зазвичай для електронних мікроскопів), а й у різних газах та рідинах.

Винайшли зондовий – скануючий тунельний мікроскоп у 1981 році співробітники Дослідницького центру фірми ІБМ Г. Біннінг та Х. Рорер (США). Через п'ять років за цей винахід вони були удостоєні Нобелівської премії.

Біннінг та Рорер спробували сконструювати прилад для дослідження ділянок поверхні розміром менше 10 нм. Підсумок перевершив найсміливіші очікування: вченим вдалося побачити окремі атоми, розмір яких у діаметрі становить лише близько одного нанометра. В основі роботи скануючого тунельного мікроскопа лежить квантово-механічне явище, яке називається тунельним ефектом. Дуже тонке металеве вістря - негативно заряджений зонд - підводиться на близьку відстань до зразка, теж металевого, позитивно зарядженого. У той момент, коли відстань між ними досягне кількох міжатомних відстаней, електрони почнуть вільно проходити через нього – «тунелювати»: через проміжок потече струм.

Дуже важливе значення для мікроскопа має різка залежність сили тунельного струму від відстані між вістрям і поверхнею зразка. При зменшенні зазору лише на 0,1 нм струм зросте приблизно 10 раз. Тому навіть нерівності розміром з атом викликають помітні коливання величини струму.

Щоб отримати зображення, зонд сканує поверхню, а електронна система зчитує величину струму. Залежно від цього, як ця величина змінюється, вістря або опускається чи піднімається. Таким чином, система підтримує величину постійного струму, а траєкторія руху вістря повторює рельєф поверхні, огинаючи височини і поглиблення.

Вістря переміщає п'єзосканер, який є маніпулятором з матеріалу, здатного змінюватися під дією електричної напруги. П'єзосканер найчастіше має форму трубки з декількома електродами, яка подовжується або згинається, переміщуючи зонд по різних напрямках з точністю до тисячних часток нанометра.

Інформація про рух вістря перетворюється на зображення поверхні, яке будується по точках на екрані. Ділянки різної висоти для наочності забарвлюються у різні кольори.

В ідеалі на кінці вістря зонда повинен бути один нерухомий атом. Якщо на кінці голки випадково виявилося кілька виступів, зображення може двоїтися, троитися. Для усунення дефекту голку труять у кислоті, надаючи їй потрібної форми.

За допомогою тунельного мікроскопа вдалося зробити низку відкриттів. Наприклад, виявили, що атоми на поверхні кристала розташовані не так, як усередині, і часто утворюють складні структури.

За допомогою тунельного мікроскопа можна вивчати лише об'єкти, що проводять струм. Однак він дозволяє спостерігати і тонкі діелектрики у вигляді плівки, коли їх поміщають на поверхню провідного матеріалу. І хоча цей ефект ще не знайшов повного пояснення, проте його успішно застосовують для вивчення багатьох органічних плівок і біологічних об'єктів – білків, вірусів.

Можливості мікроскопа великі. За допомогою голки мікроскопа навіть наносять малюнки на металеві пластини. Для цього використовують як «пишучий» матеріал окремі атоми – їх осаджують на поверхню або видаляють з неї. Таким чином, у 1991 році співробітники фірми ІБМ написали атомами ксенону на поверхні нікелевої пластини назву своєї фірми – IBM. Літера «I» становили лише 9 атомів, а літери «B» і «M» – 13 атомів кожну.

Наступним кроком у розвитку скануючої зондової мікроскопії зробили в 1986 році Біннінг, Квейт і Гербер. Вони створили атомно-силовий мікроскоп. Якщо тунельному мікроскопі вирішальну роль грає різка залежність тунельного струму від відстані між зондом і зразком, то атомно-силового мікроскопа вирішальне значення має залежність сили взаємодії тіл від відстані між ними.

Зондом атомно-силового мікроскопа служить мініатюрна пружна пластина - кантилевер. Причому один її кінець закріплений, на іншому кінці сформовано зондувальне вістря з твердого матеріалу - кремнію або нітриду кремнію. При переміщенні зонда сили взаємодії між його атомами та нерівною поверхнею зразка вигинатимуть пластину. Досягши такого переміщення зонда, коли прогин залишається постійним, можна отримати зображення профілю поверхні. Такий режим роботи мікроскопа, що називається контактним, дозволяє вимірювати з роздільною здатністю в частки нанометра не тільки рельєф, але і силу тертя, пружність і в'язкість об'єкта, що досліджується.

Сканування в контакті із зразком досить часто призводить до його деформації та руйнування. Вплив зонда на поверхню може бути корисним, наприклад, під час виготовлення мікросхем. Однак зонд здатний легко порвати тонку полімерну плівку або пошкодити бактерію, спричинивши її загибель. Щоб уникнути цього, кантилевер приводять у резонансні коливання поблизу поверхні та реєструють зміну амплітуди, частоти або фази коливань, спричинених взаємодією з поверхнею. Такий метод дозволяє вивчати живі мікроби: голка, що коливається, діє на бактерію, як легкий масаж, не завдаючи шкоди і дозволяючи спостерігати за її рухом, зростанням і поділом.

У 1987 році І. Мартін і К. Вікрама-сінгх (США) запропонували як зондуючий вістря використовувати намагнічену мікроголку. Внаслідок цього з'явився магнітно-силовий мікроскоп.

Такий мікроскоп дозволяє розглянути окремі магнітні області у матеріалі – домени – розміром до 10 нм. Його також застосовують і для надщільного запису інформації, формуючи на поверхні плівки домени за допомогою полів голки та постійного магніту. Подібний запис у сотні разів щільніший, ніж на сучасних магнітних та оптичних дисках.

На світовому ринку мікромеханіки, де заправляють такі гіганти, як ІБМ, "Хітачі", "Жіллетт", "Поляроїд", "Олімпус", "Джойл", "Діджітал інструментс", знайшлося місце і для Росії. Все голосніше чути голос маленької фірми МДТ із підмосковного Зеленограда.

«Давайте скопіюємо на пластину, в 10 разів меншу за людське волосся, наскальний малюнок, виконаний нашими далекими предками, – пропонує головний технолог Денис Шабратов. - Комп'ютер управляє "пензлем", зондом - голкою довжиною 15 мікрон, діаметром у соті частки мікрона. Голка рухається вздовж "полотна", і там, де його стосується, утворюється мазок розміром з атом. Поступово на екрані дисплея виникає олень, за яким женуть вершники».

МДТ єдина в країні фірма-виробник зондових мікроскопів та самих зондів. Вона входить до четвірки світових лідерів. Вироби фірми купують у США, Японії, Європі.

А все почалося з того, що Денис Шабратов і Аркадій Гологанов, молоді інженери одного з інститутів Зеленограда, які опинилися в кризі, думаючи, як жити далі, обрали мікромеханіку. Вони небезпідставно вважали її найбільш перспективним напрямом.

«Ми не комплексували, що доведеться змагатися із сильними конкурентами, – згадує Гологанов. - Звичайно, наше обладнання поступається імпортному, але, з іншого боку, це змушує хитрувати, ворушити мізками. А вони вже в нас точно не гірші. І готовності орати хоч греблю гати. Працювали цілодобово, без вихідних. Найважче виявилося навіть не виготовити супермініатюрний зонд, а продати. Знаємо, що наш найкращий у світі, кричимо про нього Інтернетом, засинаємо клієнтів факсами, словом, б'ємо ніжками, як та жаба, – нуль уваги».

Дізнавшись, що один із лідерів з виробництва мікроскопів – японська фірма «Джойл» шукає голки дуже складної форми, вони зрозуміли, що це їхній шанс. Замовлення коштувало багато сил та нервів, а отримали гроші. Але гроші не були головними - тепер вони могли на весь голос оголосити: знаменитий "Джойл" - наш замовник. Так майже півтора року МДТ безкоштовно виготовляла спеціальні зонди для Національного інституту стандартів і технологій США. І нове гучне ім'я з'явилося у списку клієнтів.

«Зараз потік замовлень такий, що ми вже не можемо задовольнити всіх бажаючих, – каже Шабратов. – На жаль, це специфіка Росії. Досвід показав, що у нас є сенс випускати таку наукомістку продукцію малими серіями, а масове виробництво – налагоджувати за кордоном, де немає зривів поставок, низької їх якості, необов'язковості суміжників».

Виникнення скануючої зондової мікроскопії вдало збіглося з початком бурхливого розвитку комп'ютерної техніки, що відкриває нові можливості використання зондових мікроскопів. 1998 року в Центрі перспективних технологій (Москва) створено модель скануючого зондового мікроскопа «ФемтоСкан-001», яким керують також через Інтернет. Тепер у будь-якій точці земної кулі дослідник зможе працювати на мікроскопі, а кожен бажаючий - "заглянути" в мікросвіт, не відходячи від комп'ютера.

Сьогодні подібні мікроскопи використовуються лише у наукових дослідженнях. З їх допомогою відбуваються найбільш сенсаційні відкриття в генетиці та медицині, створюються матеріали із дивовижними властивостями. Проте вже найближчим часом очікується прорив, і насамперед у медицині та мікроелектроніці. З'являться мікророботи, що доставляють по судинах ліки безпосередньо до хворих органів, створять мініатюрні суперкомп'ютери.